The structural patterns of the potentiation and the blockade of inhibitory cys-loop receptors through the transmembrane domain

Full Text

Введение

Нарушение баланса между возбуждением и торможением является причиной широкого спектра заболеваний мозга [1, 2]. Процессы торможения в нервной системе опосредованы активацией рецепторов γ-аминомасляной кислоты А типа (ГАМКАР) и глициновых рецепторов (ГлиР). Эти рецепторы не только участвуют в регуляции уровня нейрональной активности, но и являются мишенями для множества биологически активных веществ, в том числе лекарственных препаратов, способных связываться с рецептором и модулировать его функции [1, 3, 4].

ГАМКАР и ГлиР принадлежат к семейству цис-петельных лиганд-управляемых рецепторов, к которому также относятся катион-проводящие никотиновый, ацетилхолиновый и серотониновый рецепторы позвоночных [5], хлорные рецепторы, активируемые протонами, гистамином и глутаматом, у беспозвоночных [6]. У прокариот обнаружены пентамерные лиганд-управляемые каналы, в которых в целом сохранена архитектура, свойственная семейству цис-петельных рецепторов [7, 8].

Цис-петельные рецепторы состоят из 5 субъединиц, симметрично или псевдосимметрично расположенных вокруг оси канала. Найдено 8 типов субъединиц (α1–6, β1–3, γ1–3, ρ1–3, ε, π, δ и θ), из которых может быть построен ГАМКАР, однако наиболее частой комбинацией в ЦНС является α1β2γ2 с соотношением субъединиц 2 : 2 : 1 [9, 10]. ГлиР отличаются существенно меньшим разнообразием субъединиц: известны 4 типа α-субъединицы и 1 тип β-субъединицы [1]. ГлиР могут функционировать как αβ-гетеромеры (соотношение субъединиц 2 : 3 или 4 : 1) или α-гомо-олигомеры [11–14].

В структуре цис-петельных рецепторов выделяют экстраклеточный (ЭКД) и трансмембранный (ТМД) домены [15, 16] (рис. 1, А). ЭКД включает место связывания агониста, а ТМД формирует ион-проводящую пору рецептора. ТМД каждой субъединицы состоит из 4 α-спиралей (М1–М4). Пора рецептора формируется М2-спиралями (рис 1, B) и обеспечивает энергетически оптимальное перемещение ионов хлора через гидрофобный барьер мембраны.

Рис. 1. Архитектура пентамерного лиганд-управляемого рецептора.

А — вид на рецептор из плоскости мембраны. Фронтальная субъединица опущена, чтобы показать пору. Стрелка обозначает центральную ось рецептора. Обозначены трансмембранный и внеклеточный домены (ТМД и ЭКД); B — вид из внеклеточного пространства на ТМД. На выделенной цветом субъединице показаны трансмембранные спирали М1–М4. При помощи знаков +/– обозначены межсубъединичные интерфейсы; C — выравнивание аминокислотных последовательностей M1–M3 сегментов ГАМКАР и ГлиР. Последовательности ГАМКАР_α1 P14867, ГАМКАР_β1 P18505, ГАМКАР_β2 P47870, ГАМКАР_γ2 P18507, ГлиР_α1 P23415, ГлиР_α2 P23416, ГлиР_β P48167 взяты из базы данных UniProt. Выравнивание произведено относительно высококонсервативных остатков Arg 0'. Остатки, относящиеся к межсубъединичным потенцирующим сайтам, обозначены над последовательностями номерами со штрихом.

Fig. 1. Ligand-activated pentamer receptor architecture.

А — the view of the receptor in the membrane plane. The frontal subunit is omitted to demonstrate a pore. The arrow indicates the receptor central axis. The transmembrane domain (TMD) and the extracellular domain (ECD) are pointed out;

B — the extracellular view of TMD. Transmembrane chains М1–М4 are indicated on the colored subunit. Intersubunit interfaces are pointed with + and –;

C — the alignment of GABAАR and GlyR segment M1–M3 aminoacid sequences. The GABAАR_α1 P14867, GABAАR_β1 P18505, GABAАR_β2 P47870, GABAАR_γ2 P18507, GlyR_α1 P23415, GlyR_α2 P23416, and GlyR_β P48167 sequences were sourced from the UniProt Database and aligned relative to the highly conserved Arg 0' residues. Intersubunit potentiating site residues are marked with numbers and strokes above the sentences.

Лиганд-управляемые рецепторы характеризуются тремя основными функциональными состояниями: закрытым (непроводящее, агонист-несвязанное), открытым (проводящее, агонист-связанное) и десенситизированным (непроводящее, агонист-связанное). Геометрия поры изменяется при конформационном переходе канала из одного состояния в другое.

Многие агонисты и модуляторы связываются в межсубъединичных интерфейсах ЭКД и ТМД ГАМКАР и ГлиР [17–19]. При этом две стороны соседних субъединиц, которые часто обозначаются в литературе как principal/главная/+ и complementary/дополнительная/–, участвуют в формировании сайта связывания (рис. 1, B). В этой работе мы рассмотрим сайты и структурные детерминанты связывания положительных аллостерических модуляторов и блокаторов, расположенные в межсубъединичных интерфейсах ТМД и поре ГАМКАР и ГлиР, а также обсудим возможные механизмы действия этих веществ.

Геометрия поры ГАМКАР в различных функциональных состояниях

О строении поры можно судить по изображениям, полученным при помощи криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ), и рентгеновским структурам ГАМКАР и ГлиР, доступным в Protein Data Bank [20–24]. Доступна информация о структуре ГлиР во всех функциональных состояниях [21], однако релевантной структуры открытого ГАМКАР пока не существует. Ранее при помощи методов молекулярного моделирования мы изучили геометрию поры гетеромерного ГАМКАР. Для этого мы построили модели α1β2γ2 ГАМКАР по гомологии со структурами α3 ГлиР (5CFB, закрытый), α1 ГлиР (3JAE, открытый) и β3 ГАМКАР (4COF, десенситизированный) [25, 26].

Выравнивание аминокислотных последовательностей М1–М3 сегментов ТМД различных субъединиц ГАМКАР и ГлиР показано на рис. 1, С. Для облегчения сравнения различных субъединиц выработана единая система обозначения остатков [27]. Высококонсервативные остатки Arg в N-терминальной части М2-спирали принимаются за позицию 0′. Далее при движении в направлении внеклеточного вестибюля канала происходит увеличение номера остатка на единицу или уменьшение на единицу при движении в противоположном направлении (рис. 1, С). Боковые цепи остатков –2′, 2′, 6′, 9′, 13′, 16′ и 20′ направлены внутрь поры. Остатки 9′ является частью активационных ворот рецептора, а –2′ — десенситизационных ворот [15, 28].

Мы использовали компьютерную программу «CAVER 3.0» [29] для определения диаметра и визуализации пространства внутри поры (рис. 2, А). Для того чтобы охарактеризовать пору рецептора, находящегося в различных функциональных состояниях, мы применили два подхода. В работе [26] мы использовали различные шаблоны как прокариотических, так и эукариотических пентамерных лиганд-управляемых рецепторов [20–22, 30–32] для оценки размеров поры моделей ГАМКАР, построенных по гомологии. В работе [25] мы предложили методику протяжки сквозь пору сферы переменного радиуса для учёта в оценках гибкости боковых цепей аминокислотных остатков, выстилающих стенки поры.

Рис. 2. Пора ГАМКАР.

А — визуализация пространства внутри поры моделей α1β2γ2 ГАМКАР, построенных по гомологии со структурами закрытого α3 ГлиР (5CFB), открытого α1 ГлиР (3JAE) и десенситизированного β3 ГАМКАР (4COF). Изображены только М2-сегменты различных субъединиц. Фронтальная субъединица удалена для ясности. Горизонтальные линии указывают на уровни остатков -2′, 9′ и 20′, соответствующих основным сужениям поры. Отдельные субъединицы выделены сине-зелёным (α1), оранжевым (β2) и пурпурным (γ2) цветами; В — изменение диаметра от глубины поры в моделях, соответствующих закрытому, открытому и десенситизированному состояниям рецептора. Вертикальные линии указывают на уровни поры -2′, 9′ и 20′.

Fig. 2. GABAАR pore.

А — visualized space inside the pore of the α1β2γ2 GABAАR models that are homologous to the closed α3 GlyR (5CFB), open α1 GlyR (3JAE), and desensitized β3 GABAАR (4COF) structures. Only М2 segments are depicted. The frontal subunit was omitted for clarity. Horizontal lines indicate residue levels -2′, 9′, and 20′ for main pore constrictions. Some subunits are highlighted in cyan (α1), orange (β2), and purple (γ2);

В — dependence of the pore diameter on the pore depth in the closed, open, and desensitized receptor states. Vertical lines indicate pore levels -2′, 9′, and 20′.

Мы показали, что ГАМКАР имеет широкий внешний вестибюль, и по мере продвижения вглубь канала происходит немонотонное сужение поры. Диаметр внешнего вестибюля поры увеличивается по мере перехода канала из закрытого в открытое и затем в десенситизированное состояние. Наши модели предсказывают, что места наибольшего сужения поры ГАМКАР расположены на уровнях остатков –2′, 9′ и 20′ (рис. 2, В).

В закрытом состоянии кольца остатков 20′ и 9′ являются слишком узкими (2,9 и 3,3 Å соответственно) для прохождения дегидратированного иона хлора, диаметр которого, по разным оценкам, варьирует от 3,6 до 4,4 Å [33, 34]. В открытом состоянии кольца 20′ и 9′ расширяются до 9,3 и 7,6 Å, что обеспечивает свободное прохождение даже полностью гидратированного иона хлора, диаметр которого составляет 6,6 Å [35]. Наиболее узким участком поры в десенситизированном состоянии является кольцо остатков –2′ (3 Å), расположенное в районе внутриклеточного вестибюля (рис. 2, В). В открытом и закрытом состояниях диаметр этого кольца увеличивается, что подтверждает участие остатков –2′ в механизме десенситизационных ворот ГАМКАР.

Мы обнаружили также значительное сужение поры в закрытом ГАМКАР на уровне кольца 20′, которое формируется полярными и заряженными остатками (рис. 1, С). Диаметр этого кольца увеличивается почти в 3 раза в открытом канале, а в десенситизированном рецепторе сужение поры в этом месте практически исчезает (рис. 2, В). Зависимость диаметра кольца 20′ от функционального состояния рецептора позволяет предположить участие остатков этого уровня в координации ионов хлора во внешнем вестибюле ГАМКАР [36].

Неконкурентные антагонисты

Среди веществ, действующих как блокаторы ГАМКАР и ГлиР, широко распространены неконкурентные антагонисты (НКА), которые связываются в поре рецептора, не конкурируя с агонистом за ортостерический сайт связывания. К НКА относятся пикротоксин, антибиотики β-лактамного ряда, фуросемид, инсекстициды, гинкголиды, билобалид и др. Некоторые из этих веществ одновременно с блокадой поры влияют на аффинность агониста [4] и поэтому могут быть отнесены к негативным аллостерическим модуляторам. В этом разделе мы подробно рассмотрим блокирующее действие 3 НКА: алкалоида пикротоксина (ПТН), β-лактамного антибиотика пенициллина (ПН) и диуретика фуросемида (ФУР).

ПТН представляет собой эквимолярную смесь двух изомеров — прикротоксинина и пикротина. Эти соединения имеют общую структуру, за исключением того, что пикротин содержит несколько больший по размеру диметилметанол на месте изопропенильной группы прикротоксинина (рис. 3, А). Прикротоксинин более эффективно блокирует ГАМКАР и α2/3 ГлиР [4, 37], а при взаимодействии с α1 и α1β ГлиР показывает схожую эффективность с пикротином [37]. ПТН связывается с открытым рецептором и может быть заперт в поре закрытого канала (принцип ловушки), в этом случае для его диссоциации требуется повторная активация рецептора [38, 39]. ПТН уменьшает аффинность и ускоряет диссоциацию ГАМК [40, 41].

Рис. 3. Неконкурентные антагонисты ГАМКАР.

А — крио-ЭМ структура ГАМКАР (6X40) в комплексе с ПТН; B, C — связывание ПН и ФУР в поре модели ГАМКАР, построенной по гомологии со структурой бактериального рецептора GLIC (3HEZ). На фрагментах A–C представлен вид в двух проекциях: из экстраклеточного пространства (сверху) и из плоскости мембраны (снизу). На изображениях из плоскости мембраны фронтальная субъединица не показана для ясности. Показаны боковые цепи остатков 2′, 6′, 9′ и 13′, вносящих наибольший вклад во взаимодействие с блокаторами. Водородные связи изображены красными пунктирными линиями. Цветовое изображение субъединиц соответствует рис. 2.

Fig. 3. GABAАR non-competitive antagonists.

А — cryo-EM structure of GABAАR (6X40) complexed with picrotoxin;

B, C — binding of penicillin and furosemide in the pore of the GABAАR model that is homologous to the bacterial receptor GLIC (3HEZ) structure.

A–C present views from the extracellular space (top) and in the plane of membrane (bottom). The frontal subunit is omitted for clarity on the side-view images. The images show side chains of residues 2′, 6′, 9′, and 13′ that most significantly contribute to the blocker-receptor interaction. Hydrogen bonds are depicted as red dashed lines. Color subunit presentation complies with Fig. 2.

ПТН имеет форму приплюснутого эллипсоида, который идеально подходит для блокирования поры по принципу пробки в бутылочном горлышке. Крио-ЭМ структура α1β2γ2 ГАМКАР (6X40) со связанным ПТН показала, что этот блокатор вызывает окклюзию поры, связываясь между кольцами остатков 2ʹ и 6ʹ [24] (рис. 3, А). Изопропенильная группа молекулы взаимодействует с гидрофобными остатками кольца 2ʹ (рис. 1, С), а экзоциклические атомы кислорода образуют множественные водородные связи с полярными треонинами кольца 6ʹ (рис. 3, А).

Интересно, что в структурах 6HUJ и 6HUG α1β3γ2 ГАМКАР и 6UD3 α1 ГлиР изопропенильная группа ПТН направлена вверх и образует гидрофобные контакты с лейцинами активационных ворот 9ʹ, при этом треонины 6ʹ также образуют водородные связи с атомами кислорода ПТН. Во всех известных структурах связывание ПТН осуществляется ниже активационных ворот рецептора, что является молекулярной основой механизма «ловушки». Данные мутационных экспериментов о вовлечённости остатков колец 2ʹ, 6ʹ и 9ʹ в связывание ПТН [42–44], а также построенные ранее структурные модели связывания ПТН в поре ГАМКАР и ГлиР [25, 37, 45, 46] хорошо согласуются с полученными недавно крио-ЭМ структурами 6X40, 6HUJ, 6HUG и 6UD3.

К НКА относятся также антибиотик ПН и диуретик ФУР (рис. 3, B, С). Эти вещества в миллимолярных концентрациях блокируют открытые ГАМКАР и ГлиР [47–50]. Хотя очевидно, что анионные лиганд-управляемые рецепторы не являются основной мишенью для этих препаратов, их передозировка может привести к нежелательным побочным эффектам. Эпилептогенные свойства ПН задокументированы с 1940-х гг. [51, 52].

При регистрации ГАМК-активируемых токов в изолированных клетках Пуркинье мозжечка крысы мы установили, что ПН и ФУР, в отличие от ПТН, действуют по механизму последовательного блока и препятствуют диссоциации агониста и переходу ГАМКАР в закрытое состояние до диссоциации самого блокатора [49, 50]. Такой механизм, известный также под названием «нога в двери», был описан ранее для nAchR [53] и NMDA-рецепторов [54].

Используя метод Монте-Карло минимизации (МКМ) энергии [55], мы определили структурные детерминанты связывания ПН и ФУР в поре модели открытого α1β2γ2 ГАМКАР, построенной по гомологии с бактериальным рецептором GLIC (2XQ3). Для этого мы осуществляли пошаговую протяжку молекулы лиганда через пору рецептора с одновременным поворотом молекулы вокруг своей оси и применяли на каждом шаге протокол МКМ [50, 56, 57]. Структурные модели связывания ПН и ФУР в поре α1β2γ2 ГАМКАР, соответствующие минимуму энергии лиганд- рецепторных взаимодействий, показаны на рис. 3, B, C.

ПН связывается между кольцами остатков 2ʹ и 9ʹ, образует водородные связи с полярными остатками кольца 6ʹ и взаимодействует с гидрофобными остатками кольца 9ʹ (рис. 3, B). Фенильное кольцо ПН заходит в межсубъединичный интерфейс и, таким образом, препятствует переходу рецептора в закрытое состояние. ФУР, в отличие от ПН и ПТН, связывается выше на уровне колец остатков 6ʹ–13ʹ, образует водородные связи с полярными треонинами 13ʹ и взаимодействует с гидрофобными лейцинами 9ʹ (рис. 3, С), влияя на активационные ворота рецептора.

ПТН, ПН и ФУР вызывают окклюзию поры, однако при этом молекулярные механизмы их действия кардинально различаются. Если ПТН, запертый в поре, в отсутствие ГАМК стабилизирует закрытое состояние, то ПН и ФУР стабилизируют открытое блокированное состояние рецептора.

Общие анестетики, барбитураты и фенаматы: от потенциации к торможению

Внутривенные/общие анестетики (этомидат — ЭТМ и пропофол — ПФЛ) и барбитураты (фенобарбитал — ФБЛ) оказывают анестетическое действие на ЦНС. Эти вещества в низких микромолярных концентрациях потенцируют ГАМКАР [58, 59], эффективные концентрации для потенциации ГлиР — примерно на порядок больше [60, 61]. Фенаматы (мефенамовая и нифлумовая кислота, МФК и НФК) широко применяются в клинической практике как нестероидные противовоспалительные средства [62], однако они легко проникают через гематоэнцефалический барьер и могут взаимодействовать с нейрональными рецепторами [63].

Общие анестетики и барбитураты оказывают двойственное влияние на ГАМК- и глицинергические токи: в низких концентрациях они усиливают вызванные аппликацией агониста токи, а при увеличении концентрации начинает превалировать блокирующий эффект [60, 64]. Кривая доза–ответ фенаматов по отношению к ГАМК-активируемым токам также имеет колоколообразный вид [65–67]. НФК слабее других фенаматов потенцирует ГАМКАР [68] и оказывает только блокирующее действие на ГлиР [69]. Все указанные соединения (за исключением НФК) в высоких концентрациях способны активировать ГАМКАР в отсутствие ГАМК [59, 64, 67, 70], и только ПФЛ вызывает прямую активацию ГлиР [60, 61]. ЭТМ, ПФЛ, ФБЛ и МФК при потенциации ГАМКАР увеличивают аффинность агониста [4, 67, 71].

Общие анестетики, барбитураты и фенаматы сходным образом влияют на кинетику ГАМК- и глицин-активируемых токов. Аппликация ЭТМ, ПФЛ и ФБЛ приводила к увеличению длительности ГАМК- и глицинергических мТПСТ за счёт увеличения постоянной времени деактивации рецептора [72–75]. Исследования одиночных ГАМКАР показали, что эти вещества не изменяют проводимость рецепторов, но увеличивают как вероятность перехода, так и время жизни рецептора в открытом состоянии [76–78]. Мы показали, что МФК и НФК также увеличивают постоянную времени спада ТПСТ в изолированных клетках Пуркинье [67] и срезах мозжечка крысы [79].

Фенаматы и общие анестетики действуют на ГАМКАР сходным образом. Рецепторы, содержащие β2/3-субъединицу, потенцируются МФК и ЭТМ значительно эффективнее по сравнению с рецепторами c β1-субъединицей [65, 80]. Это различие связано с остатком 15′ M2-спирали (рис. 1, С). Замена у α1β2(N15′S)γ2-рецепторов значительно снижала потенцирующий эффект, а при обратной замене у α1β1(S15′N)γ2-рецепторов потенцирующий эффект, наоборот, усиливался.

В экспериментах с [³H]ази-ЭТМ были выявлены 2 остатка β2-M3 Met36′ и α1-М1 Met(–19′), которые участвуют в связывании общих анестетиков [82]. Мутационные эксперименты подтвердили важность этих остатков для потенцирующего действия ЭТМ и ПФЛ на ГАМКАР [71, 83, 84]. Боковые цепи остатков β2 Asn15′, Met36′ и α1 Met(-19′) направлены в интерфейс между этими субъединицами. Недавно полученные крио-ЭМ-структуры 6X3V и 6X3T ГАМКАР подтвердили, что потенцирующий сайт связывания ЭТМ и ПФЛ расположен в трансмембранном β(+)/α(–)-интерфейсе [24].

R.F. Halliwell с соавт. предположили, что ЭТМ и МФК могут иметь общий сайт связывания [65]. Мы исследовали потенциацию ГАМК-активируемых токов в изолированных клетках Пуркинье при совместной аппликации МФК и ЭТМ и установили, что их потенцирующие эффекты не являются аддитивными [67]. Следовательно, наши данные подтверждают, что эти вещества действуют через общий сайт связывания.

D.J. Laurie и соавт. показали, что в клетках Пуркинье мозжечка крыс экспрессируется наиболее распространённый в ЦНС тип α1β2/3γ2 ГАМКАР [85]. Основываясь на этих данных, мы построили модель α1β2γ2 ГАМКАР по гомологии со структурой открытого 3JAE α1 ГлиР [67], а также использовали структуру 6HUP десенситизированного α1β3γ2 ГАМКАР [86]. Мы установили, что размер и геометрия трансмембранных β(+)/α(–)-интерфейсов в части, включающей сайт связывания общих анестетиков и фенаматов, в открытом и десенситизированном рецепторе хорошо совпадают.

Структурные модели связывания МФК и НФК в β(+)/α(–)-интерфейсе ГАМКАР показаны на рис. 4, А, В. Важную роль при связывании отрицательно заряженных при физиологических pH МФК и НФК играет взаимодействие с положительно заряженным Arg19′ и полярным Asn15′ остатками β2-субъединицы, с которыми у лигандов формируются водородные связи. Фенаматы стабилизируются в сайте связывания также через ван-дер-ваальсовы взаимодействия с гидрофобными остатками β2-M3 Met36′, Phe39′ и α1-M1 Pro(–22′), Met(–19′). НФК менее глубоко проникает в сайт связывания со стороны поры из-за анион-π отталкивания между тремя атомами фтора, несущими отрицательные парциальные заряды, и остатком β2 Phe39′ (рис. 4, В). В результате МФК сильнее взаимодействует с остатками Arg19′ и Asn15′, что, как мы покажем ниже, может влиять на потенциацию ГАМКАР [67].

Рис. 4. Потенциация и торможение ГАМКАР фенаматами.

Потенцирующие сайты связывания МФК (А) и НФК (В) в β(+)/α(−)-трансмембранном интерфейсе модели α1β2γ2 ГАМКАР, построенной по гомологии со структурой 3JAE α1 ГлиР. C — наложение моделей α1β1γ2 и α1β2γ2 ГАМКАР в области β(+)/α(−)-интерфейса. Боковая цепь R19′ в β2-субъединице окрашена в зелёный цвет; D — энергетический профиль НФК в поре модели α1β2γ2 ГАМКАР; E — структурные модели связывания НФК в поре в верхнем и нижнем сайтах. На фрагментах А, B и E показаны боковые цепи остатков, которые вносят значительный вклад (> 1 ккал/моль) в энергию лиганд-рецепторных взаимодействий. Водородные связи показаны красными пунктирными линиями. Цветовое представление субъединиц такое же, как на рис. 2.

Fig. 4. Fenamate GABAАR potentiation and inhibition.

The potentiating sites of binding meclofenamic acid (MFA; А) and niflumic acid (NFA; В) in β(+)/α(−) transmembrane interface of the α1β2γ2 GABAАR model that is homologous to the 3JAE α1 GlyR structure.

C — superposition of the α1β1γ2 и α1β2γ2 GABAАR models in the β(+)/α(−) interface region. R19′ side chain in β2 subunit is green;

D — NFA energy profile in the pore of the α1β2γ2 GABAАR model;

E — structural models of NFA binding in the pore at the upper and lower sites.

А, B, and E present residue side chains that significantly contribute (>1 kcal/mol) to the energy of ligand-receptor interaction. Hydrogen bonds are depicted as red dashed lines. Color presentation of subunits complies with Fig. 2.

В обзоре 2021 г. мы подробно рассмотрели особенности связывания общих анестетиков и барбитуратов c потенцирующими сайтами ГАМКАР [87]. ЭТМ, как и МФК, взаимодействует с полярным остатком β2 Asn15ʹ [24, 86]. ЭТМ и ПФЛ, как и фенаматы, формируют сильные ван-дер-ваальсовы связи с остатками β2 М3 Phe39ʹ, Met36ʹ и α1 М1 Met(–19′), Pro(–22ʹ), Leu(–23ʹ).

ФБЛ связывается в трансмембранных γ(+)/β(–)- и α(+)/β(–)-интерфейсах ГАМКАР [24]. Сайт связывания ФБЛ гомологичен сайту общих анестетиков/фенаматов и находится на уровне остатка M2 15′. Гомологом Asn15′ β2-субъединицы является Ser в α1- и γ2-субъединицах (рис. 1, С). Структурные модели связывания ФБЛ предсказывают, что замещение Ser на Asn в позиции 15′ приводит к стерическому конфликту с лигандом, что должно препятствовать его попаданию в β(+)/α(–)-интерфейс. ФБЛ стабилизирован в своих сайтах связывания в основном за счёт ван-дер-Ваальсовых взаимодействий с гидрофобными остатками обеих субъединиц.

Как мы уже указывали выше, с ростом концентрации фенаматов потенцирующий эффект сменяется торможением ГАМКАР [67]. Связывание МФК и НФК происходит в поре, на что указывают потенциал-зависимость блока и появление кратковременных хвостовых токов при диссоциации лиганда [66, 67]. Мы также продемонстрировали наличие быстрой и медленной кинетики блока, что предполагает существование нескольких сайтов связывания в поре ГАМКАР [67]. При блокаде ГлиР НФК также связывается в поре [69].

Энергетический профиль НФК в поре модели α1β2γ2 ГАМКАР показан на рис. 4, D. При определении блокирующих сайтов мы протягивали молекулу фенамата через пору с одновременным вращением вокруг её длинной оси и в каждой точке сетки применяли протокол МКМ для определения энергии взаимодействия лиганд–рецептор [67]. Два минимума на кривой указывают на сайты связывания НФК, расположенные в верхней и нижней частях поры (рис. 4, Е).

Наши модели предсказывают, что НФК в верхнем сайте формирует водородную связь с остатком γ2 Lys20′ и взаимодействует с полярными α1 Asn20′, Thr13′ и гидрофобными γ2 Ile17', α1 Ile16' остатками (рис. 4, Е). В нижнем сайте превалируют ван-дер-Ваальсовые контакты между НФК и гидрофобными остатками колец -2' − 2'. Для полной окклюзии поры необходимы 2 молекулы НФК.

Возможные механизмы потенциации ГАМКАР и ГлиР общими анестетиками, барбитуратами и фенаматами

Остатки β2 Arg19′ и α1 Gln(–26′) являются высококонсервативными среди ГАМКАР и ГлиР, исключением является только β-субъединица ГлиР (рис. 1, С). Наши модели предсказывают важность этих остатков при потенциации ГАМКАР фенаматами. Массивная боковая цепь аргинина в отрытом состоянии рецептора направлена внутрь трансмембранного β(+)/α(–)-интерфейса, образует водородные связи с кислородами основной цепи остатков Gln(–26′) и Ile(–27′) α1-субъединицы (рис. 4, A, B) и по принципу «нога в дверь» препятствует переходу канала в закрытое состояние. Боковая цепь остатка Gln(–26′) направляет боковую цепь Arg19′ внутрь β(+)/α(–)-интерфейса. МФК и НФК, находясь в сайте связывания, стабилизируют положение боковой цепи Arg19′ и потенцируют рецептор, увеличивая время его жизни в открытом состоянии.

Мы проанализировали направление боковых цепей этих остатков среди всех доступных в Protein Data Bank структур ГАМКАР и ГлиР и обнаружили, что в структурах рецепторов, соответствующих открытому/десенситизированному состоянию, боковая цепь остатка Arg19′ c главной/(+) стороны межсубъединичного интерфейса предпочтительно направлена в сторону интерфейса, а боковая цепь остатка Gln(–26′) c дополнительной/(–) стороны интерфейса — в противоположную сторону (рис. 5, А). В структурах рецепторов, соответствующих закрытому состоянию, наблюдается обратное направление боковых цепей этих остатков (рис. 5, В).

Рис. 5. Структурные детерминанты потенциации ГлиР.

А, B — ТМД α1 ГлиР в открытом (3JAE) и закрытом (3JAD) состоя-ниях. Показаны боковые цепи остатков R19′ и Q(–26′). Структуры 3JAE и 3JAD показаны, как выложены в Protein Data Bank, без предварительной минимизации энергии. С–Е — вид из плоскости мембраны на трансмембранные β(+)/α(−) (С), α(+)/β(−) (D) and β(+)/β(−) (E) интерфейсы модели α1β ГлиР, построенной по гомологии со структурой 3JAE. Показаны участки M1–M3 спиралей и боковые цепи остатков, гомологичных участвующим в связывании МФК в β(+)/α(−)-интерфейсе α1β2γ2 ГАМКАР. Водородные связи показаны красными пунктирными линиями. Отдельные субъединицы выделены сине-зеленым (α1) и оранжевым (β) цветами.

Fig. 5. Structural determinants of GlyR potentiation.

А, B — TMD of α1 GlyR in open (3JAE) and closed (3JAD) states. The images present residue side chains R19′ and Q(–26′). 3JAE and 3JAD structures are shown as they are laid out in Protein Data Bank without preliminary energy minimization.

С–Е — view of the transmembrane β(+)/α(−) (С), α(+)/β(−) (D), and β(+)/β(−) (E) interfaces of the α1β GlyR model in the membrane plane that are homologous to the 3JAE structure. The figure presents the parts of the M1–M3 helices and the residue side chains that are homologous to those involved in MFA binding on the β(+)/α(−) interface of α1β2γ2 GABAАR. Hydrogen bonds are depicted as red dashed lines. Some subunits are highlighted in cyan (α1) and orange (β).

Предложенный нами механизм позволяет объяснить специфичность эффекта потенциации ГАМКАР фенаматами по отношению к β-субъединице рецептора [65, 81]. Мы построили модель α1β1γ2 ГАМКАР и обнаружили, что боковая цепь Arg19′ может быть захвачена водородными связями более короткой боковой цепью Ser15′ (рис. 4, С). При этом Arg19′ теряет способность образовывать водородные связи с остатками противоположной субъединицы.

Крио-ЭМ структуры 6X3V, 6X3T и 6X3W α1β2γ2 ГАМКАР в связанном с ЭТМ, ПФЛ и ФБЛ состоянии не выявили взаимодействие этих лигандов с остатком Arg19′ с главной/(+) стороны межсубъединичного интерфейса [24]. Мы предполагаем, что эти лиганды, заходя в свой сайт связывания со стороны мембраны, а не поры, вытесняют боковую цепь Arg19′ из интерфейса, подменяя ее собой. Так, ПФЛ и ФБЛ в сайте связывания сами образует водородную связь с атомом кислорода основной цепи остатка М1 (–27ʹ) с дополнительной/(–) стороны интерфейса.

Arg19′ и Gln(–26′) играют важную роль в стабилизации открытого состояния гомо-олигомерных ГлиР [88, 89]. Установлено, что наследственные мутации R19′Q, R19′L и Q(–26′)E являются причиной такого неврологического заболевания, как гиперэксплексия, при котором повышенный рефлекс испуга проявляется совместно с усилением мышечного тонуса в ответ на внезапные внешние раздражители [90]. A. Bode и соавт. предположили, что мутации остатка Arg19′ приводят к потере возможности образования водородных связей с Gln(–26′) и, как следствие, к дестабилизации открытого состояния ГлиР [88].

Общие анестетики и барбитураты потенцируют ГлиР менее эффективно по сравнению с ГАМКАР [60]. Основываясь на предложенном нами молекулярном механизме потенциации, мы проанализировали структуру межсубъединичных интерфейсов α1 и α1β ГлиР. В αβ ГлиР (с соотношением субъединиц 2 : 3) существуют три типа межсубъединичных интерфейсов: β(+)/α(–), α(+)/β(–) и β(+)/β(–) [12].

Мы построили модель гетеро-олигомерного α1β ГлиР по гомологии со структурой 3JAE α1 ГлиР. Интересно отметить, что β-субъединица ГлиР в области М2-сегмента имеет необычно низкую гомологию по отношению к другим субъединицам ГАМКАР и ГлиР (рис. 1, С). В β(+)/α(–)- и β(+)/β(–)-интерфейсах ГлиР в позициях 15′ и 19′ β-субъединицы с главной/(+) стороны интерфейса находятся Cys и Ala соответственно (рис. 5, С, Е). Боковая цепь Ala19′ не может выполнять функцию стабилизации открытого состояния рецептора по принципу «нога в дверь». В α(+)/β(–)-интерфейсе позицию 19′ α1-субъединицы занимает Arg, однако в β-субъединице в позиции -26′ находится Gly (рис. 5, D). Боковая цепь глицина, представленная одним атомом водорода, не может ограничивать подвижность боковой цепи аргинина, для которого оказывается энергетически более выгодным повернуть боковую цепь в сторону анион-проводящей поры.

Гомо-олигомерный α1–3 ГлиР имеет 5 одинаковых α(+)/α(–)-интерфейсов, в которых в позициях 19′ и –26′ с (+)- и (–)-стороны интерфейса находятся Arg и Gln соответственно (рис. 1, С). Однако в позиции 15′ находится Ser. Как мы показали выше, Ser может захватить боковую цепь Arg через образование водородных связей (рис. 5, F) и таким образом сделать потенцирующее действие положительных аллостерических модуляторов менее эффективным.

У αβ ГлиР отсутствуют структурные детерминанты, необходимые для потенциации через трансмембранные межсубъединичные интерфейсы. Однако проблема со стехиометрическим соотношением субъединиц в αβ ГлиР не разрешена окончательно. Ранее сообщалось о возможности сборки αβ ГлиР со стехиометрией субъединиц 3 : 2 [91, 92], также опубликована крио-ЭМ структура рецептора с соотношением субъединиц 4 : 1 [14]. В этом случае у ГлиР появляются один или несколько α(+)/α(–)-интерфейсов, через которые может осуществляться потенциация в соответствии с предложенным нами механизмом.

Заключение

ГАМКАР и ГлиР являются мишенью для различных групп препаратов, действующих как положительные или отрицательные аллостерические модуляторы. В настоящем обзоре на основе анализа собственных и литературных данных мы рассмотрели основные характеристики связывания и возможные механизмы действия НКА, общих анестетиков, барбитуратов и фенаматов, которые оказывают модулирующее действие через ТМД. В эти группы веществ входят клинически важные препараты. Более глубокое понимание структурных закономерностей и молекулярных механизмов взаимодействия этих агентов с ГАМКАР и ГлиР будет способствовать разработке новых лекарств для лечения различных неврологических и психических заболеваний и минимизации их побочных эффектов.

Благодарность. Вычисления производились на базе центра коллективного пользования сверхвысокопроизводительными вычислительными ресурсами ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».

Источник финансирования. Автор заявляет об отсутствии внешних источников финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Автор декларирует отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

About the authors

Alexey V. Rossokhin

Author for correspondence.
Email: alrossokhin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7024-7461

Cand. Sci. (Phys.-Math.), leading researcher, Laboratory of functional synaptology, Brain Institute

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Ligand-activated pentamer receptor architecture. А — the view of the receptor in the membrane plane. The frontal subunit is omitted to demonstrate a pore. The arrow indicates the receptor central axis. The transmembrane domain (TMD) and the extracellular domain (ECD) are pointed out; B — the extracellular view of TMD. Transmembrane chains М1–М4 are indicated on the colored subunit. Intersubunit interfaces are pointed with + and –; C — the alignment of GABAАR and GlyR segment M1–M3 aminoacid sequences. The GABAАR_α1 P14867, GABAАR_β1 P18505, GABAАR_β2 P47870, GABAАR_γ2 P18507, GlyR_α1 P23415, GlyR_α2 P23416, and GlyR_β P48167 sequences were sourced from the UniProt Database and aligned relative to the highly conserved Arg 0' residues. Intersubunit potentiating site residues are marked with numbers and strokes above the sentences.

Download (408KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. GABAАR pore. А — visualized space inside the pore of the α1β2γ2 GABAАR models that are homologous to the closed α3 GlyR (5CFB), open α1 GlyR (3JAE), and desensitized β3 GABAАR (4COF) structures. Only М2 segments are depicted. The frontal subunit was omitted for clarity. Horizontal lines indicate residue levels -2′, 9′, and 20′ for main pore constrictions. Some subunits are highlighted in cyan (α1), orange (β2), and purple (γ2); В — dependence of the pore diameter on the pore depth in the closed, open, and desensitized receptor states. Vertical lines indicate pore levels -2′, 9′, and 20′.

Download (992KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. GABAАR non-competitive antagonists. А — cryo-EM structure of GABAАR (6X40) complexed with picrotoxin; B, C — binding of penicillin and furosemide in the pore of the GABAАR model that is homologous to the bacterial receptor GLIC (3HEZ) structure. A–C present views from the extracellular space (top) and in the plane of membrane (bottom). The frontal subunit is omitted for clarity on the side-view images. The images show side chains of residues 2′, 6′, 9′, and 13′ that most significantly contribute to the blocker-receptor interaction. Hydrogen bonds are depicted as red dashed lines. Color subunit presentation complies with Fig. 2.

Download (274KB)

Indexing metadata

5. Fig. 4. Fenamate GABAАR potentiation and inhibition. The potentiating sites of binding meclofenamic acid (MFA; А) and niflumic acid (NFA; В) in β(+)/α(−) transmembrane interface of the α1β2γ2 GABAАR model that is homologous to the 3JAE α1 GlyR structure. C — superposition of the α1β1γ2 и α1β2γ2 GABAАR models in the β(+)/α(−) interface region. R19′ side chain in β2 subunit is green; D — NFA energy profile in the pore of the α1β2γ2 GABAАR model; E — structural models of NFA binding in the pore at the upper and lower sites. А, B, and E present residue side chains that significantly contribute (>1 kcal/mol) to the energy of ligand-receptor interaction. Hydrogen bonds are depicted as red dashed lines. Color presentation of subunits complies with Fig. 2.

Download (306KB)

Indexing metadata

6. Fig. 5. Structural determinants of GlyR potentiation. А, B — TMD of α1 GlyR in open (3JAE) and closed (3JAD) states. The images present residue side chains R19′ and Q(–26′). 3JAE and 3JAD structures are shown as they are laid out in Protein Data Bank without preliminary energy minimization. С–Е — view of the transmembrane β(+)/α(−) (С), α(+)/β(−) (D), and β(+)/β(−) (E) interfaces of the α1β GlyR model in the membrane plane that are homologous to the 3JAE structure. The figure presents the parts of the M1–M3 helices and the residue side chains that are homologous to those involved in MFA binding on the β(+)/α(−) interface of α1β2γ2 GABAАR. Hydrogen bonds are depicted as red dashed lines. Some subunits are highlighted in cyan (α1) and orange (β).

Download (321KB)

Indexing metadata