Role of Inflammatory Mediators, Growth Factors, and Osteodystrophy in Recurrent Lumbar Disk Herniation

Full Text

Введение

Хирургическое удаление грыжи межпозвонкового диска (ГМПД) поясничного отдела позвоночника является одним из наиболее часто проводимых вмешательств в нейрохирургической практике. Не менее актуальна реоперация пациентов после перенесённого хирургического вмешательства из-за возникшего рецидива ГМПД с возобновлением болевого радикулопатического синдрома. Согласно данным литературы встречаемость такой проблемы составляет 2–15% случаев [1, 2]. Каждое повторное хирургическое вмешательство на позвоночнике у больных с ГМПД достоверно снижает вероятность достижения хорошего результата в послеоперационном периоде. Данная проблема диктует необходимость персонифицированной оценки факторов риска и прогнозирования вероятности развития рецидива ГМПД перед оперативным вмешательством для выбора актуальной тактики хирургического лечения.

Межпозвонковый диск (МПД) в силу своего расположения эволюционно исключён из процессов иммунологической толерантности, однако при его дегенерации и экструзии, сопровождающейся нарушением целостности фиброзного кольца, пульпозное ядро начинает взаимодействовать с иммунной системой как инородное тело. В результате развивается каскад иммуновоспалительных процессов, приводящих к активации В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов и лизису ГМПД [2], формированию в сегменте элемента хронического воспаления, не дающего в кратчайший срок сформироваться фиброзу МПД на прооперированном уровне. В результате повторного пролабирования остатков пульпозного ядра и фиброзного кольца развиваются рецидивы ГМПД.

Несмотря на противоречивые данные результатов клинических и экспериментальных исследований патогенетических механизмов развития дегенерации МПД установлено, что ведущее значение принадлежит хроническому иммуновоспалительному процессу, ускоряющему и усугубляющему дегенерацию и катаболическое разрушение структур МПД [3]. Эти процессы сопровождаются изменением содержания медиаторов иммунорегуляторных процессов [4–7]:

• провоспалительных цитокинов — интерлейкина-6 (ИЛ-6), фактора некроза опухоли-α (ФНО-α);
• хемокинов — ИЛ-8, моноцитарного хемоаттрактантного протеина-1 (MCP1);
• факторов роста — васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF), трансформирующего фактора роста-β1 (ТФР-β1);
• биомаркеров остеодеструктивных процессов — остеопротегерина (ОПГ), матриксной металлопротеиназы-8 (ММР-8) и др.

Цель исследования — оценить характер изменения уровня медиаторов воспаления, факторов роста и остеодистрофических процессов в развитии рецидивов ГМПД.

Материалы и методы

Научная работа проводилась на клинических базах кафедр нейрохирургии ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» (РМАНПО) и ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Ра- зумовского». Образцы крови и экстракты ткани МПД анализировали на кафедре лабораторной диагностики ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» и в лаборатории РМАНПО.

Проведены обследование и оперативное лечение 68 пациентов: 41 (60,3%) мужчины и 27 (39,7%) женщин. Средний возраст пациентов составил 58 ± 1,5 (18–74) года, средний отслеживаемый катамнез — 3,5 ± 1,5 года. Все пациенты дали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Работа одобрена локальным этическим комитетом РМАНПО (протокол № 12 от 12.11.2019).

Критерии включения:

• радикулопатический болевой синдром, вызванный компрессией нервных корешков на уровне поясничного отдела позвоночника ГМПД поясничного отдела;
• радикулопатический болевой синдром, вызванный компрессией нервных корешков на уровне поясничного отдела позвоночника, рецидивом ГМПД поясничного отдела.

Критерии исключения:

• возраст < 18 лет и старше 74 лет;
• выраженная соматическая патология в стадии клинической декомпенсации;
• психотическое состояние и/или тяжёлое психотическое заболевание в анамнезе;
• наличие гнойно-септического процесса в зоне планируемого хирургического вмешательства;
• сочетание грыж или рецидивов ГМПД с дегенеративным стенозом позвоночного канала, спондилолистезом;
• травматические поражения позвоночника; наличие нестабильности поясничного отдела позвоночника на функциональных рентгенограммах.

Основную группу составили пациенты (n = 41), которым было выполнено хирургическое вмешательство в объёме микрохирургического удаления ГМПД: 21 пациент с рецидивами ГМПД на уровне поясничного отдела позвоночника, 20 пациентов с ГМПД на уровне поясничного отдела позвоночника, у которых не было рецидива грыжи МПД за время отслеживаемого катамнеза.

Для достоверной прогностической значимости этих факторов как риска развития рецидива ГМПД была сформирована контрольная группа — 19 пациентов, которые не испытывали корешковых болей, не наблюдались у невролога, получили оперативное лечение по поводу травматического перелома поясничного отдела позвоночника. До операции у пациентов этой группы забирали кровь для исследования, во время оперативного вмешательства брали биопсию ткани МПД, удаляемого во время хирургического вмешательства.

Биохимические показатели также исследовали у 8 пациентов, перенёсших до поступления два вмешательства на позвоночнике — по поводу первичной ГМПД на уровне поясничного отдела позвоночника, а затем по поводу рецидива ГМПД на ранее прооперированном уровне, без установки фиксирующих конструкций.

Для оценки медиаторов иммунорегуляторных процессов интраоперационно брали образцы ткани компримирующего невральные структуры субстрата средним объёмом 10 мм³, которые помещали в 0,155 М раствор NaCl, размешивали в миксере в течение 30 мин, полученную суспензию центрифугировали, надосадочную жидкость хранили при –80ºС. Образцы крови, взятые у пациентов до оперативного лечения, центрифугировали, выделяли сыворотку, разделяли на аликвоты и хранили при –80ºC. Субстрат компрессии и сыворотку крови исследовали с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа и коммерческих наборов реагентов («Вектор Бест»), определяли концентрацию медиаторов иммунорегуляторных процессов: ИЛ-6, ИЛ-8, MCP-1, MMP-8, VEGF, ОПГ, ФНО-α. Для исследования ТФР-β1 применяли трёхстадийный «сэндвич»-вариант иммуноферментного анализа с использованием моно- и поликлональных антител к этим цитокинам («R&D Systems»). С целью гистологической верификации диагноза выполнено гистологическое исследование полученных в ходе операции биоптатов тканей.

Для анализа полученных результатов были созданы базы данных на основе программы «Microsoft Exсel 2020». Они формировались на основе историй болезни пациентов с ГМПД и их рецидивами, операционных журналов, данных лабораторных и лучевых методов исследования. Статистические показатели рассчитывали с использованием пакета прикладных программ «Statistica v. 10.0» («StatSoft»).

Результаты

В экстракте ткани МПД было увеличено содержание всех медиаторов воспалительного процесса, что подтверждает экспрессию хемокинов и факторов роста, запуск иммуновоспалительного процесса, нарушающего гомеостаз костной ткани и МПД. О прогрессировании дегенерации МПД свидетельствуют значимый подъём уровня МСР-1, VEGF, ТФР-β1, MMP-8 и снижение — ОПГ. Экстракт ткани МПД пациентов основной группы отличает высокий уровень МСР-1, факторов роста, снижение ОПГ и увеличение ММР-8.

В основной группе наиболее значимые различия обнаружены для показателя ММР-8 по отношению к контрольной группе (в среднем на 25,5; р = 0,0001; табл. 1). Уровень VEGF в основной группе по отношению к контрольной группе увеличен на 3105,4 (р < 0,0001), МСР-1 — в среднем на 871,2 (р < 0,0001).

 

Таблица 1. Уровень медиаторов иммунорегуляторных процессов в сыворотке крови обследованных лиц (M ± SD) / Table 1. The levels of serum immunoregulatory mediators in the study population (M ± SD)

Показатель Parameter	Основная группа Main group (n = 41)	Контрольная группа Control group (n = 19)	р
ИЛ-6 Interleukin-6	53,68 ± 68,50	7,01 ± 2,77	< 0,0001
ИЛ-8 Interleukin-8	28,34 ± 32,29	7,38 ± 3,23	0,1436
ФНО-α Tumor necrosis factor-α	13,12 ± 6,69	2,47 ± 1,16	< 0,0001
МСР-1 Monocyte chemoattractant protein-1	285,52 ± 107,72	190,55 ± 95,25	0,0071
VEGF	525,73 ± 319,58	324,92 ± 90,20	0,0952
ТФР-β1 Transforming growth factor-β1	38 332,97 ± 14 641,34	29 127,78 ± 17 574,24	0,0041
ММР-8 Matrix metalloproteinase-8	53,92 ± 30,81	12,23 ± 4,26	< 0,0001
ОПГ Osteoprogesterin	2,82 ± 0,85	3,88 ± 2,40	0,4827

 

В сыворотке крови локальные изменения уровня медиаторов иммунорегуляторных процессов в экстракте ткани МПД сопровождаются значимым повышением уровня ИЛ-6, ФНО-α, МСР-1, VEGF и ММР-8. Такие же различия обнаружены для ФНО-α — в основной группе его уровень увеличен по отношению к контрольной в среднем на 10,7 (р < 0,0001), уровень ИЛ-6 — в среднем на 46,7 (р < 0,0001). Уровень ММР-8 в основной группе по отношению к контрольной повысился в среднем на 41,7 (р < 0,0001). Значимые для хронического иммуновоспалительного процесса изменения биомаркеров в экстракте ткани МПД и в сыворотке крови выявлены только для МСР-1, ТФР-β1 и MMP-8 (табл. 2).

 

Таблица 2. Уровень медиаторов иммунорегуляторных процессов в экстракте ткани МПД обследованных лиц (M ± SD) / Table 2. The levels of immunoregulatory mediators in the extracted spinal disc tissue in the study population (M ± SD)

Показатель Parameter	Основная группа Main group (n = 41)	Контрольная группа Control group (n = 19)	р
ИЛ-6 Interleukin-6	39,83 ± 22,21	28,56 ± 5,38	0,5996
ИЛ-8 Interleukin-8	127,86 ± 78,16	86,37 ± 9,91	0,4334
ФНО-α Tumor necrosis factor-α	10,83 ± 5,91	9,83 ± 3,17	0,8181
МСР-1 Monocyte chemoattractant protein-1	990,17 ± 472,30	118,99 ± 27,32	< 0,0001
VEGF	3 677,95 ± 1 377,93	572,56 ± 149,19	< 0,0001
ТФР-β1 Transforming growth factor-β1	14 970,90 ± 23 427,02	2 113,33 ± 628,07	0,0029
ММР-8 Matrix metalloproteinase-8	27,44 ± 25,00	1,90 ± 0,55	0,0001
ОПГ Osteoprogesterin	35,08 ± 12,88	47,65 ± 4,15	0,0265

 

Значимые для хронического иммуновоспалительного процесса изменения биомаркеров в экстракте ткани МПД и в сыворотке крови выявлены только для МСР-1, ТФР-β1 и MMP-8 (рис. 1–3).

 

Рис. 1. Размах значения МСР-1 в сыворотке крови (А) и экстракте ткани МПД (В). / Fig. 1. The range of МСР-1 levels in the blood serum (А) and the extracted spinal disc tissue (В).

 

Рис. 2. Размах значения ТФР-β1 в сыворотке крови (А) и экстракте ткани МПД (В). / Fig. 2. The range of TGF-β1 levels in the blood serum (А) and the extracted spinal disc tissue (В).

 

Рис. 3. Размах значения ММР-8 в сыворотке крови (A) и экстракте ткани МПД (В). / Fig. 3. The range of ММР-8 levels in the blood serum (А) and the extracted spinal disc tissue (В).

 

Оценка взаимосвязи между уровнями иммунорегуляторных медиаторов в экстракте ткани МПД и сыворотке крови с помощью метода ранговой корреляции Спирмена представлена в табл. 3. Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови имеет сильную положительную корреляционную связь с уровнем МСР-1 в экстракте ткани диска, а также умеренную положительную корреляцию с содержанием VEGF в экстракте ткани МПД, ТФР-β1 и ММР-8. Возможно, увеличение одного показателя ведёт к увеличению другого. Обращает на себя внимание значительная положительная корреляционная связь уровня ММР-8 в сыворотке крови с концентрацией в экстракте ткани МПД МСР-1, VEGF и ММР-8, а также умеренная положительная корреляция с показателем ТФР-β1. Вероятно, увеличение одного показателя ведёт к увеличению другого.

 

Таблица 3. Коэффициенты корреляции Спирмена между медиаторами иммунорегуляторных процессов в экстракте ткани МПД и сыворотке крови / Table 3. Spearman correlation coefficients for ranking correlation between immunoregulatory mediators in the serum and the extracted spinal disk tissue

Показатель Parameter	МСР-1, экстракт ткани МПД Extracted spinal disk tissue МСР-1	VEGF, экстракт ткани МПД Extracted spinal disk tissue VEGF	TФР-β1, экстракт ткани МПД Extracted spinal disk tissue TGF-β1	ММР-8, экстракт ткани МПД Extracted spinal disk tissue ММР-8
ИЛ-6, сыворотка крови Serum IL-6	0,81	0,63	0,61	0,66
ММР-8, сыворотка крови Serum ММР-8	0,86	0,75	0,62	0,84
ФНО-α, сыворотка крови Serum TNF-α	0,78	0,75	0,7	0,77

Примечание. Во всех случаях — статистическая значимость на уровне p ≤ 0,01.

Note. In all cases the level of statistical significance was p ≤ 0.01.

 

Для содержания ФНО-α в сыворотке крови характерна сильная положительная корреляционная связь с уровнями в экстракте ткани диска МСР-1, VEGF, ММР-8 и ТФР-β1. Увеличение содержания одного показателя в экстракте ткани МПД сопровождается нарастанием его уровня в сыворотке крови. Это даёт основание считать, что из 8 определяемых показателей иммунорегуляторных процессов статистически значимые связи между их уровнями в сыворотке крови и экстракте ткани МПД имеют МСР-1 (Rs = 0,52; p ≤ 0,01), VEGF (Rs = 0,62; p ≤ 0,01), ТФР-β1 (Rs = 0,52; p ≤ 0,01) и ММР-8 (Rs = 0,84; p ≤ 0,01). Выявленные положительные значимые корреляционные связи между данными показателями дают основание считать, что основой деструктивных процессов на уровне МПД являются хронические воспалительные процессы, возникающие вследствие нарушения взаимодействия между макрофагами и клетками МПД. Эти процессы приводят к выбросу провоспалительных цитокинов/хемокинов, факторов роста (VEGF, ТФР-1β), нарастанию уровня ММР-8 как в очаге формирования грыжи, так и на уровне всего организма.

На следующем этапе проведена сравнительная оценка прогностической значимости биохимических факторов в сыворотке крови и в биоптате ткани, компримирующей нервные структуры, при разных патологиях. Установлено, что у пациентов из группы с однократным рецидивов ГМПД лидирующими статистически значимыми факторами с повышением уровней рисков от 76,5% до 84,6% являются ММР-8, ФНО-α, ТФР-β1, МСР-1, VEGF, ОПГ, в то время как у пациентов из группы с повторным рецидивом ГМПД лидирующими статистически значимыми факторами с повышением уровней рисков от 66,7% до 88,9% являются ФНО-α, МСР-1, ИЛ-6 и VEGF. Поскольку дегенеративно-дистрофические процессы, которые приводят к возникновению рецидива ГМПД, проходят непосредственно в МПД, мы провели сравнительный анализ взаимосвязи биохимических показателей в сыворотке крови пациентов и биоптате компримирующего нервные структуры субстрата, полученного в ходе оперативного лечения. При анализе полученных результатов с помощью вычисления коэффициента корреляции Спирмена наибольшая корреляция в сыворотке крови и биоптате компримирующего субстрата отмечается в показателях МСР-1 (Rs =0,520), VEGF (Rs =0,62), ТФР-β1 (Rs =0,52) и ММР-8 (Rs =0,84) с повышением уровней рисков от 76,5% до 84,6% (p ≤ 0,01).

После установки показателей наиболее высокой корреляции в сыворотке крови и биоптате компримирующего нервные структуры субстрата необходимо было удостовериться, что полученные показатели имеют высокий уровень различий в группах с рецидивами ГМПД и безрецидивной группе, а также обладают высоким риском развития рецидива ГМПД по данным математического анализа (табл. 4).

 

Таблица 4. Итоги анализа дискриминантной функции / Table 4. Discriminant function analysis

Фактор Factor	Лямбда Уилкса Wilks’ lambda	F-исключение F exclusion (2,25)	Р	1-толерантность (r-кв.) 1-tolerance (sq. r.)
VEGF в сыворотке крови Serum VEGF levels	0,150901	23,23609	0,000002	0,023734
ММР-8 в сыворотке крови Serum MMP-8 levels	0,124995	17,10093	0,000021	0,039612
ТФР-β1 в сыворотке крови Serum TGF-β1 levels	0,066886	3,339796	0,000518	0,059763

 

На основании изучения данных можно сделать выводы, что для прогнозирования развития рецидива ГМПД достаточно 3 факторов: VEGF > 4676,82 ± 1469,93, MMP8 > 15,67 ± 4,48 и ТФР-β1 > 4634,27 ± 959,85.

Обсуждение

Как показал анализ результатов исследования, прогрессирующее увеличение уровня провоспалительных цитокинов, выявленное у пациентов с ГМПД, можно считать основным фактором, поддерживающим эскалацию дегенеративных процессов ткани диска. Изменение уровня провоспалительных цитокинов/хемокинов в экстрактах ткани ГМПД и сыворотке крови позволяет считать, что его основой является активация взаимодействия между макрофагами и клетками МПД, приводящая к продукции воспалительных цитокинов.

Цитокины инициируют следующие процессы:

• активацию синтеза факторов роста (VEGF, ТФР-β1) в тканях биоптата компримирующего невральные структуры грыжевого содержимого;
• нарастание уровня ММР-8 и снижение содержания ОПГ в экстракте интраоперационного биоматериала и сыворотке крови, что подтверждает тяжесть дегенеративных процессов на уровне МПД.

Особенности изменения исследуемых медиаторов иммунной системы в группах пациентов с дегенеративно-дистрофическими изменениями на уровне поясничного отдела позвоночника, представленные в ряде исследований, и полученные нами данные подтверждают, что воспалительная реакция и неоангиогенез играют определяющую роль в формировании рецидивов ГМПД. Исследование уровня биомаркеров воспаления, роста и остеодистрофических процессов в экстрактах ткани МПД и сыворотки крови показало достоверную связь между подъёмом уровня ФНО-α, MCP-1, VEGF, ТФР-β1 и ММР-8 в тканях грыжевого выпячивания и сыворотке крови.

Нарастание уровня в сыворотке крови биомаркеров воспалительного процесса, факторов роста и ММР-8 можно считать показателями тяжести дегенеративных процессов на уровне МПД и их рецидивов. Исследование уровня представленных в работе биомаркеров иммунорегуляторных процессов может быть использовано при разработке персонифицированного подхода к выбору тактики хирургического лечения.

About the authors

Vladimir A. Chekhonatskiy

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Author for correspondence.
Email: fax-1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6155-1154

postgraduate student, Department of neurosurgery

Russian Federation, Moscow

Oleg N. Dreval

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: odreval@nsi.ru
ORCID iD: 0000-0002-8944-9837

D. Sci. (Med.), Professor, Head, Department of neurosurgery

Russian Federation, Moscow

Aleksei V. Kuznetsov

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: akuznetsov@nsi.ru
ORCID iD: 0000-0002-9487-6008

Cand. Sci. (Med.), Associate Professor, Department of neurosurgery

Russian Federation, Moscow

Andrey A. Chekhonatskiy

Saratov State Medical University named after V.I. Razumovsky

Email: fax-1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3327-1483

D. Sci. (Med.), Head, Department of neurosurgery

Russian Federation, Saratov

Natalya B. Zakharova

Saratov State Medical University named after V.I. Razumovsky

Email: lipidgormon@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0289-3562

D. Sci. (Med.), Professor, Department of clinical laboratory diagnostics

Russian Federation, Saratov

Elena A. Grishina

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: ncmu@almazovcentre.ru
ORCID iD: 0000-0002-5621-8266

D. Sci. (Med.), Professor, Director, Research Institute of Molecular and Personalized Medicine

Russian Federation, Moscow

Aleksandr V. Gorozhanin

S.P. Botkin City Clinical Hospital

Email: agorozhanin@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-3593-7034

Cand. Sci. (Med.), Head, Neurosurgery department No. 19

Russian Federation, Moscow

Vera V. Volna

S.P. Botkin City Clinical Hospital

Email: neurosurgeon-sidorenko@mail.ru

neurosurgeon, Neurosurgery department No. 19

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files